AM真菌孢子分子鉴定方法

方法一：

（一）AM真菌孢子的挑取

1.将含有孢子的土样倒入搅拌器中，加入适量的水并进行搅拌；

2.把40目、120目和400目的筛子从上到下依次摆好，将搅拌器中的土样倒入最上层（40目）的土筛中，并进行多次冲洗，确保搅拌器中的土样倒入土筛中；

3.将中层（120目）和下层（400目）的土筛中的土样冲洗到培养皿中，放置于显微镜下观察；

4.将形态大小相同并有明显活性特征的孢子挑取至装有适量去离子水的500ulEP管（可置于4℃保存）。

（二）AM真菌孢子的清洗

1.将装有孢子的500ulEP管放入超声波仪器，设置40Hz，2min进行超声波清洗；

2.取出EP管，放入离心机中设置8000r/min进行离心1min；

3.用移液枪吸出离心后EP管中的去离子水（！注意，别吸到底部的孢子）后加入适量无菌水。重复一次。

4.用10ul移液枪吸出孢子置于装有少量无菌水的表面皿，放于显微镜下观察，轻轻搅拌清洗后将孢子吸入另一个装有少量无菌水的表面皿中，前后共清洗5次。

（三）AM真菌孢子DNA的提取

1.将清洗好的孢子依次单个挑取于200ulEP管（控制好水量，尽量少的让水存在于200ulEP管中），并做好标号；

2.点燃酒精灯，将剪刀反复在火焰上灭菌2min，待冷却后便可剪掉10ul移液枪的枪头前端1/3处，并吸取10ul 20% Chelex-100加入到含有单个孢子的EP管中，进行充分研磨使孢子破碎；

3.向研磨好孢子的EP管中加入10ul的10× EX Taq buffer(Takara)，并进行沸水浴加热10min，后立即取出冰浴5min；

4.取出冰浴后的EP管，放入离心机进行15000 r/min离心5 min，然后吸取上清液转至新的无菌 EP管中，上清液即为提取的孢子 DNA 液（置于-20℃保存）

（四）第一次PCR体系的建立

1.引物的配制：将原装引物的离心管放入离心机，离心8000r/min，30s，取出后加入适量ddH₂O，随后利用震荡仪进行震荡使其混匀，置于-20℃保存。

2.PCR混合溶液配置和上样：每支200ulEP管应含有25ulPCR混合溶液，其中12.5ulPCRmix，8.5ulddH₂O，1ul引物1，1ul引物2，2ulDNA模板。

3.进行第一次PCR扩增。

（五）第二次PCR体系的建立

1.取出第一次扩增好的EP管，稀释100倍，利用震荡仪使其混合均匀，作为第二次PCR体系的DNA模板。

2.其余步骤与第一次PCR体系建立的步骤相同，另外加入两组CK（不加入2ulDNA模板，而是加入2ulddH₂O至PCR混合溶液中）

3.进行第二次PCR扩增。

（六）跑胶和测序

1.配置TAE溶液：将储存液状态下的TAE溶液用无菌水稀释50倍，使其变为工作液状态即可使用。

2.制胶：制作1%琼脂糖胶（0.25g琼脂糖+25mlTAE，0.5g琼脂糖+50mlTAE，1.0g琼脂糖+100mlTAE，根据样品数量选择），将称量好的琼脂糖倒入三角瓶中，随后加入对应的TAE溶液，放入微波炉使琼脂糖完全溶解后取出，待稍微冷却后加入1~2ul的DNAgreen，轻微摇晃后倒入对应的制胶板，插入制孔牌后等待20—30min使其凝固成胶。

3.跑胶：将已完全凝固的胶放入电泳仪中（将有孔的一侧朝着负极），倒入适量的TAE使其没过胶，在第一个孔中加入6ul的DNAmarker，在随后的孔中依次加入3ul的第二次PCR扩增混合溶液，设定电泳仪的电流150mA，电压120V，时间20-30min进行跑胶。

4.成像：将跑好的胶放入成像仪中，设定300nm的波长，利用电脑扫描成像，调节清晰后保存。

5.送测：如成像后CK无亮带，且样品有亮带即可送测。填写样品对应编号，目的DNA片段长度和引物名称后，将样品和引物（分装至小EP管，每个样品只需1ul引物）包装封口后送测。

（七）建立系统发育树

1.将已完成测序的序列整理归类后，利用NCBI网站Blast链接进行序列比对，下载与原序列相似度在97%以上的相似序列（如用的SSU引物，则必须下载SSU的相似序列）。

2.利用Mega7软件建立系统发育，即可看出孢子的属种。

方法二：

（一）单孢DNA的提取

将孢子收集到装有ddH₂O的PCR管中，置于超声频率为40KHZ的超声波仪中清洗3min，转移至干净培养皿中，在体视镜下夹取单个孢子至含10μl ddH₂O的PCR管中，在体视镜下将单孢压碎后置于80℃水浴7min即获得单孢DNA，置于4℃短期保存备用。进行PCR扩增前，用迷你离心机离心3min，转速为10000转/分，吸取上清9μl为单孢DNA。

（二）PCR扩增

1.针对SSU-ITS-LSU区段，第一次PCR利用SSUmAf-LSUmAr引物组合(Krüger et al．2009)扩增约1.8-kb大小的DNA片段。

2.第二次PCR的引物为SSUmCf-LSUmBr(Krüger et al．2009)。

3.第二轮PCR的产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，利用PCR产物纯化试剂盒对阳性PCR产物进行纯化。

（三）建立克隆文库

1.将纯化后的PCR产物连接至pGEM-T载体。

2.连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞并构建克隆文库。