AM真菌菌种资源的收集和分离培养方法

1.AM真菌样品采集

采用五点取样法，采集植物根系及其根围土壤样品。根围土壤采集：去掉地表大块沙石和其他杂质，用酒精消毒过的干净铁铲沿宿主植物根系周围往下挖，连根带土放入塑料袋，写清采样号。另外将根系的土轻轻抖落，再将根系放入封口塑料袋中，写清采样号，放入冰盒中带回实验室处理。

对采样点的行政地点、地理坐标、地形、植被、土壤类型、宿主植物生长状况进行调查、记录。

采集的根样带回实验室后，应立即清洗，用吸水纸吸干水分，放入50%酒精或FAA固定液[福尔马林(38%甲醛)5mL+冰醋酸5mL+70%酒精90mL］进行固定。土壤分成三部分：一部分最好立即进行诱导培养；另一部分放入-20℃进行保存，用于提取土壤DNA；第三部分自然风干收存，用于测定土壤理化性状，也可用于记录孢子数、鉴定种属和分离培养菌种资源。

2.AM真菌诱导培养

采用盆栽的方法。将采集的土壤样品与灭菌的河沙（1:1）混匀，在温室内播种玉米对AM菌进行诱导培养，培养4个月后，用以分离AM真菌孢子。

说明：土壤AM真菌诱导培养所选择的宿主有多种。本项目组多年来冬季用三叶草，其它时间用玉米为AM繁殖的宿主。AM真菌繁殖一个周期的时间为4个月，这与玉米的生长周期相当。

3.孢子的分离提取

土壤或盆栽培养物中AM真菌孢子的分离提取采用湿筛倾析法，步骤如下：

（1）称取20~50g土壤或盆栽培养物样品倒入食品搅拌器中，加约600ml水。

（2）开启搅拌器3~5s，打碎后的材料立即倒出，将上层液依次通过3个土壤标准筛（上层60目，中层120目，下层400目），加水再次过滤2~3次，大部分砂砾残余物留在食品搅拌机中。

（3）用流水冲洗每层筛子，直至流出的水是清水。上层含有大的根段、碎屑和大孢子，大孢子能大到用肉眼看到并检出。中层全部转移到培养皿中。下层最后冲洗的时候将残余物轻轻冲洗汇集到筛子的一边，用洗瓶加入少量水，让残余物充分混匀，静置1~2s，将悬浊液倒入培养皿中，如此反复3~4次，直至悬浊液澄清。

（4）用0.5~10μl的移液枪在体视显微镜下从皿中挑取孢子，放入表面皿（加少许水）中，再从表面皿挑取孢子至另一个表面皿，除去孢子表面上的杂质（菌丝和碎屑），包括游离的任何菌丝片段，如此反复3~4次，直至皿内无杂质，最后装进1.5ml离心管（标记），4℃保存。

（5）将前面挑出的孢子按形态分类。分类时，先把数量多的一类挑出来，并在本子上做记录（记下形态特征），然后再挑下一类，最后再返回来一个一个检查挑出来的是否一致，一致就可装进离心管4℃保存。

4.单孢培养：

玉米种子用10%双氧水消毒10分钟，无菌水冲洗3~5次，无菌水浸泡若干小时，无菌沙播种，提前3~4天播种（长出约3片叶子即可）。

花盆底部放一张圆纸片（防无菌沙漏出），侧面写标签，底部铺一层无菌沙，用移液枪吸取新鲜、光亮、饱满的单个孢子，将孢子放在玉米苗根部（不能放在苗根与茎相接那一部分根，应向下一点，嫩一点的部位，便于AM菌侵染），再放4~5粒双氧水处理过的玉米粒，再铺一层无菌沙（手不能碰到根部），摆放好花盆，浇水浸湿（有一点点水浸出）。温室培养至少4个月。