AM真菌菌株分离纯化培养方法

1.AM真菌富集培养

采用盆栽的方法。将采集的土壤样品与灭菌的河沙（1:1）混匀，在温室内播种玉米对AM菌进行富集培养，培养4个月后，用以分离AM真菌孢子。

说明：土壤AM真菌富集培养所选择的宿主有多种。本项目组多年来冬季用三叶草，其它时间用玉米为AM真菌繁殖的宿主。AM真菌繁殖一个周期的时间为4个月，这与玉米的生长周期相当。便于检测AM真菌的孢子含量。

2.AM真菌单孢分离培养

2.1筛土样

采用五点取样法，采集果树根系及其根围土壤样品。把样品土样过20目筛网，装100~200g于封口袋中（写编号）。供筛孢子用。

2.2挑单孢

（1）称取适量之前所筛土样于培养皿中，再倒入搅拌器中，加约300ml水；

（2）开启搅拌器4~5s，将上层液缓慢倒入已摆放好的筛中（上层60目，中层120目，下层400目），加水再次过滤2~3次上清液；

（3）筛子一层层冲洗，上层不要，中层全部倒入培养皿中，下层打散3~4次取上清液倒入皿中；

（4）用0.5~10μl的移液枪在体视显微镜（2X）下从皿中挑单孢，放入表面皿（加一点水）中，挑三次至皿内无杂质，最后装进1.5ml离心管（标记），4℃保存。

2.3单孢分类

将前面挑出的孢子进行分类。分类时，先把数量多的一类挑出来，并在本子上做记录（记下形态特征），然后再挑下一类，最后在返回来一个一个检查挑出来的是否一样，一致就可装进离心管4℃保存。

2.4播种玉米

玉米种子用10%双氧水消毒，提前3~4天播种（长出约3片叶子既可）。

2.5单孢分离培养：

花盆底部放一张圆纸片（防无菌砂漏出），侧面写标签，底部铺一层无菌沙，单孢用移液枪吸出放置玉米苗根部（不能放在苗根与茎相接那一部分根，应向下一点，嫩一点的部位，便于AM菌侵染），再放4~5粒双氧水处理过的玉米粒，再铺一层无菌沙（手不能碰到根部），摆放好花盆，浇水浸湿（有一点点水浸出）。培养4个月后，用以分离AM真菌孢子。

说明：一般取完土样后，AM真菌富集培养和单孢分离培养同时进行，用以后面孢子鉴定。

3.孢子密度的测定

取100g土样用湿筛倾注-蔗糖离心法，筛取孢子，在体视显微镜下于底部有分格的线虫计数皿内计数，测定孢子密度。

4.孢子种类的鉴定

在体视镜下先观察记录孢子的颜色、大小、连孢菌丝的特征、孢子果形态等。在此基础上，用毛细吸管挑取新鲜的AM真菌孢子置于载玻片上，加浮载剂（如水、乳酸、乳酸甘油、PVLG等）后，在Nikon E-600显微镜下观察，记录孢子的形状、大小、颜色、表面纹饰，孢子内含物、连孢菌丝的数目、宽度及形状、孢壁结构，辅助细胞（土生泡囊），外生菌丝及附属结构产孢子囊等特征；同时辅助使用Melzer's试剂、棉蓝试剂，观察孢子的特异反应，对有代表性或特异性的特征进行拍照。根据孢子的形态特征，采用Schü?ler& Walker（2010）的分类系统，并参阅Schenck & Perez（1988）的“VA菌根真菌鉴定手册和相关网站：http://invam.caf.wvu.edu（INVAM, West Virginia University, USA）；http://www.zor.zut.edu.pl/Glomeromycota/Taxonomy.html（Department of Plant Pathology, University of Agriculture in Szczecin,Poland）及http://www.lrz.de/~schuessler/amphylo/amphylogeny.html的鉴定资料以及近几年发表新种的原始描述，进行种属的检索、鉴定。对于难确定的种或可能的新种、新记录种进一步进行单孢培养，获得大量的同源孢子，再确定种类，部分种类采用分子生物学方法辅助鉴定。AM真菌孢子以Melzer's : PVLG = 1 : 1或PVLG为浮载剂制成玻片标本，密封、编号、并进行贮藏。